小動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶行為檢測(cè)技術(shù)

               －－－－避暗法                          

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

1、學(xué)習(xí)小白鼠學(xué)習(xí)記憶行為檢測(cè)方法

   2、學(xué)習(xí)小鼠避暗自動(dòng)測(cè)試儀的使用方法。

   3. 了解影響學(xué)習(xí)記憶功能的一些因素。

二、實(shí)驗(yàn)原理

    嚙齒類動(dòng)物系夜行性動(dòng)物，喜歡黑暗的地方，而回避光亮之地。它將設(shè)法逃向暗處，此時(shí)在暗處給予其電刺激，小鼠會(huì)被迫逃回明亮處，并獲得記憶。根據(jù)此原理設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)為一次性被動(dòng)回避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

被動(dòng)回避反應(yīng)（Passive Avoidance Response）為二十世紀(jì)60年代后期發(fā)展起來的、普遍用于檢測(cè)小動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的一種動(dòng)物模型。反應(yīng)特征：動(dòng)物必須學(xué)會(huì)躲避可怕的事件，而抑制其天然本性。被動(dòng)回避反應(yīng)有：避暗法（又稱步入法step-through test）、跳臺(tái)法（又稱步下法step-down test）等。

三、實(shí)驗(yàn)器材

小白鼠 常用手術(shù)器械、亞**鈉、東莨菪堿（scopolamine，Scop.）、生理鹽水、35 %酒精。

四、實(shí)驗(yàn)步驟 

1. 實(shí)驗(yàn)儀器

小鼠避暗自動(dòng)測(cè)試儀由控制器和活動(dòng)箱兩部分組成，可同時(shí)對(duì)6只小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。明暗實(shí)驗(yàn)箱之間有一小門供動(dòng)物進(jìn)出，當(dāng)動(dòng)物進(jìn)入暗室被電擊時(shí)，它可自動(dòng)記錄小鼠次從明室進(jìn)入暗室的潛伏期和受到電擊的次數(shù)，還可通過按鍵靈活地選擇刺激電壓和設(shè)置實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

2. 實(shí)驗(yàn)程序：

2.1適應(yīng)：將動(dòng)物頭朝室壁放入明室，兩室之間的門洞敞開，讓動(dòng)物在兩室內(nèi)自由活動(dòng)2-3分鐘，取出后放回飼養(yǎng)籠。

2.2訓(xùn)練：第二天, 將動(dòng)物放入明室, 它很快鉆入暗室, 連接兩室的門洞關(guān)閉，同時(shí)啟動(dòng)電刺激器, 動(dòng)物足部受電擊。如果動(dòng)物在次訓(xùn)練時(shí)超過100秒不進(jìn)暗室, 淘汰之或用手把它輕輕趕進(jìn)暗室。

記錄指標(biāo)：

（1）記錄動(dòng)物自明室進(jìn)入暗室的潛伏期，可作為判斷給藥后動(dòng)物行為是否有變的一個(gè)指標(biāo)。若藥物致使動(dòng)物鎮(zhèn)靜，則潛伏期顯著長(zhǎng)于對(duì)照組。

（2）記錄動(dòng)物受到電擊后的反應(yīng)，如劇烈嘶叫并跳躍，評(píng)為A級(jí)反應(yīng)；微弱尖叫，評(píng)為B級(jí)反應(yīng)；不叫，評(píng)為C級(jí)反應(yīng)。受到電擊后動(dòng)物一般均跳躍。C級(jí)反應(yīng)常伴動(dòng)物跳躍，動(dòng)物雖不尖叫，但正常動(dòng)物均能感受電擊疼痛，顯示好的記憶成績(jī)。C級(jí)反應(yīng)多見于雄性動(dòng)物。A級(jí)反應(yīng)多見于雌性動(dòng)物。該記錄可作為動(dòng)物痛域是否變化的一個(gè)輔助觀察指標(biāo)。

2.3重測(cè)試：訓(xùn)練后24小時(shí)（第三天），再次將動(dòng)物放入明室，進(jìn)行重測(cè)試。

記錄指標(biāo)：

（1）記錄動(dòng)物進(jìn)入暗室的潛伏期，為步入潛伏期（step through latency, STL）。潛伏期設(shè)為300秒。

（2）記錄動(dòng)物300秒內(nèi)進(jìn)入暗室的錯(cuò)誤次數(shù)，包括次錯(cuò)誤進(jìn)入暗室的次數(shù)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)舉例

按照信息論將記憶簡(jiǎn)單劃分為：記憶的獲得（也即學(xué)習(xí)過程、信息的獲得過程）、記憶的鞏固（信息的保持過程）、記憶的再現(xiàn)（信息的提取過程）時(shí)，我們可依此來篩選作用于記憶不同階段的認(rèn)知藥物。

在訓(xùn)練前、后或重測(cè)前給損傷動(dòng)物記憶的藥物，可分別觀察該藥物對(duì)記憶不同階段的影響，在此之前給動(dòng)物待檢測(cè)認(rèn)知藥物，即可依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷該認(rèn)知藥物對(duì)抗損傷藥物的效果。為簡(jiǎn)化篩選工作，常選用實(shí)驗(yàn)步驟較少的小動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶測(cè)試方法，現(xiàn)以步入法為例說明如下。原理如圖示。

適應(yīng) ———— 訓(xùn)練（電擊）——— （24小時(shí)后）——— 重測(cè)（不電擊）

       影響           影響                    影響

        記憶獲得       記憶鞏固                記憶再現(xiàn)

一、記憶獲得過程

1. 建立記憶獲得障礙模型：

在動(dòng)物進(jìn)行電擊訓(xùn)練之前15-20分鐘，給動(dòng)物腹腔注射氫溴酸東莨菪堿（膽堿能M受體拮抗劑，HBr-Scopalamine），小鼠：3mg/kg，可見給藥組動(dòng)物出現(xiàn)探究行為，訓(xùn)練時(shí)在明室內(nèi)駐留時(shí)間略長(zhǎng)于對(duì)照組，進(jìn)入暗室后受到電刺激時(shí)的反應(yīng)與對(duì)照組相似：嘶叫或跳躍。24小時(shí)后當(dāng)再次將動(dòng)物放入明室時(shí)，動(dòng)物進(jìn)入暗室的潛伏期顯著低于對(duì)照組，即制備成功記憶障礙模型。

2. 待測(cè)藥物的服用：

根據(jù)待檢測(cè)藥物在動(dòng)物體內(nèi)的作用高峰時(shí)間，于相應(yīng)時(shí)間給動(dòng)物服藥，如口服藥物，可于訓(xùn)練前1小時(shí)給動(dòng)物灌服待檢測(cè)藥物，然后再于訓(xùn)練前15-20分鐘給動(dòng)物損傷記憶獲得的藥物，如氫溴酸東莨菪堿等。

二、記憶鞏固過程

1. 建立記憶鞏固障礙模型：

動(dòng)物電擊訓(xùn)練結(jié)束后立即給動(dòng)物腹腔注射蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺（Cycloheximide，小鼠：90-100mg/kg）抑制蛋白質(zhì)合成，或皮下注射NaNO2（小鼠：120mg/kg）導(dǎo)致動(dòng)物短暫性缺氧，或給動(dòng)物施行頭部瞬間電休克。然后放回飼養(yǎng)盒內(nèi)，24小時(shí)后重測(cè)試。

2. 待測(cè)藥物的服用：

若是口服藥物，于電擊訓(xùn)練前藥物作用高峰期（一般選1小時(shí)前）給動(dòng)物灌服藥物。若是腹腔注射藥物，一般于訓(xùn)練前半小時(shí)注射。然后給動(dòng)物電擊訓(xùn)練，訓(xùn)練后立即給損傷記憶鞏固藥物或其它實(shí)驗(yàn)因素，24小時(shí)后重測(cè)試，可檢測(cè)認(rèn)知藥物對(duì)記憶鞏固障礙的對(duì)抗作用。

三、記憶再現(xiàn)過程

1. 建立記憶再現(xiàn)障礙模型

于動(dòng)物重測(cè)試之前15分鐘給小鼠灌服酒精（35%，0.1ml/10g鼠重），15分鐘后進(jìn)行重測(cè)試。可見小鼠記憶提取過程受到損傷。

2. 待測(cè)藥物的服用：于動(dòng)物重測(cè)試之前1小時(shí)給動(dòng)物口服待檢藥物。

注意：

該損傷只有在重測(cè)前10-30分鐘灌胃酒精才起作用, 時(shí)間長(zhǎng)于30分鐘則無效。

該劑量酒精只對(duì)較不鞏固、一次性記憶有損傷作用，而對(duì)小鼠需經(jīng)多次訓(xùn)練而獲得的較鞏固的記憶的再現(xiàn)無影響。

附： 步下法（step-down test），又稱跳臺(tái)法 

實(shí)驗(yàn)原理：

依據(jù)動(dòng)物的習(xí)性，嚙齒類動(dòng)物在空曠的場(chǎng)地內(nèi)，大多時(shí)間會(huì)逗留于墻邊或角落。而被放在高臺(tái)上時(shí)，便會(huì)依本能迅速跳下，躲避在墻邊或墻角。跳臺(tái)儀的底部可以通電，上面放置一個(gè)絕緣的跳臺(tái)。動(dòng)物在訓(xùn)練時(shí)受到電擊，跳上跳臺(tái)以躲避電擊，從而獲得記憶。動(dòng)物的記憶力下降時(shí)，表現(xiàn)為次從跳臺(tái)跳下的潛伏期縮短，跳下的次數(shù)增加。動(dòng)物的記憶力增強(qiáng)時(shí)則跳下的潛伏期延長(zhǎng)，觸電次數(shù)明顯減少。 

實(shí)驗(yàn)程序

1. 適應(yīng)：將動(dòng)物放上平臺(tái)，使動(dòng)物在箱內(nèi)自由上下適應(yīng)2-3分鐘，然后將動(dòng)物放回飼養(yǎng)盒。或每次適應(yīng)10秒，共適應(yīng)3次，間隔30分鐘。后者使動(dòng)物較前者更能充分適應(yīng)實(shí)驗(yàn)者的手勢(shì)和整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。

2. 訓(xùn)練：可在適應(yīng)之后立即進(jìn)行，也可在適應(yīng)后24小時(shí)進(jìn)行。

將動(dòng)物再次放上平臺(tái), 同時(shí)開啟電刺激器, 箱底銅柵供電。動(dòng)物由于在箱內(nèi)適應(yīng)過，幾乎馬上跳下平臺(tái)，四肢于是立即遭到電擊。由于電擊的疼痛，動(dòng)物上下跳躍，偶爾于無意之中跳回平臺(tái)，旋即又跳下平臺(tái)，如此反復(fù)多次。

記錄指標(biāo)：

1）動(dòng)物從放上平臺(tái)至跳下平臺(tái)的潛伏期；

2）動(dòng)物反復(fù)下臺(tái)的錯(cuò)誤次數(shù), 可代表動(dòng)物的學(xué)習(xí)成績(jī)；

3. 重測(cè)試：

訓(xùn)練后24小時(shí)重測(cè)試, 再次將動(dòng)物放上平臺(tái)，觀察動(dòng)物下臺(tái)情況。

記錄指標(biāo)：

動(dòng)物自放上平臺(tái)后至跳下平臺(tái)的潛伏期、5 分鐘內(nèi)跳下平臺(tái)的錯(cuò)誤次數(shù), 此為動(dòng)物的記憶成績(jī)。