恒遠：NK細胞介導的細胞溶解作用的研究

參考文獻  

上海恒遠生物科技有限公司是國內首批進口elisa試劑盒經銷商，主要做的產品有生物試劑，血清，標準品，培養基，elisa試劑盒，勁馬公司是國內眾多大型企業以及醫院的產品供應商，為了迎接中秋和國慶節，從即日日產品一律八折出售，給購買產品的客戶提供免費代測的服務，歡迎前來購買和咨詢。

前言

自然殺傷細胞（Nature Killer Cells, NK）是骨髓衍化的淋巴細胞，其*初通過巨大的顆粒性狀被識別。NK細胞能自發殺滅多種腫瘤細胞，同時還可保護正常的細胞，從而被認為是癌癥的克星。*重要的是，不管是在胞內還是胞外，NK細胞不需要免疫接種或提前激活，就能夠自發溶解特定的腫瘤靶細胞，而T細胞必須要通過抗原遞呈細胞的協助才能發揮作用。許多胞內外的實驗表明, 除了外滲出和滲入腫瘤組織的能力外，NK細胞還有望具有抗腫瘤的能力。研究發現缺失NK細胞的小鼠在致癌物誘下更容易發產生癌癥。另外，缺乏NK細胞的小鼠會持續遭受病毒感染，并很快死亡。很多疾病的發生會伴隨NK細胞失控或出現不正常反應，包括移植排斥，糖尿病，各種自身免疫和神經性疾病,再生障礙性貧血或白血球減少癥。因此，NK細胞在決定各生理狀態和疾病狀態中起著舉足輕重的作用。同時， 監測NK細胞的細胞溶解活性，不僅可應用于監視癌癥、傳染病和自身免疫性疾病的免疫活性，而且可應用于搜尋介導細胞溶解效應的蛋白。

測量NK細胞溶解活性的傳統標準方法是用⁵¹Cr或¹¹¹In進行放射性標記分析。

在這些分析中，靶細胞被放射性標記，然后與效應細胞混合。在給定時間內（低于四小時）檢測放射性同位素的釋放（與NK細胞介導的細胞溶解有關）。也可以使用一些非放射性標記方法進行檢測，包括流式細胞術，基于ELISA的顆粒酶測量，及利用顯微鏡進行形態學分析3。

由ACEA 公司及羅氏應用科學部共同開發的實時無標記細胞分析系統xCELLigence，使動態監測NK細胞介導的細胞溶解成為可能。xCELLigence基于阻抗技術（RT-CES®）^4,5，貼附于E-Plate的96孔板孔中的細胞，其貼壁能力及相互作用都會導致阻抗發生變化，同時，阻抗的變化與貼壁細胞的數量，大小，形狀變化都有關系。相反，向板孔中加入懸浮細胞，因為其不與檢測板電阻接觸或者只是微弱接觸，所以不引起電阻抗變化。因此，NK細胞介導的單層癌細胞細胞溶解效應，可在E-Plate上進行動態的定量監測，而無需對靶細胞進行額外的標記。

材料和方法

細胞

NK 92, NIH 3T3細胞以及試驗中用到的所有的癌細胞均購自ATCC，小鼠NK細胞（mNK）由Louisville大學Hui Shao博士提供。所有的細胞均培養在5% CO2，37°C的培養箱中，NK92和mNK細胞在含有2 mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氫鈉，0.2 mM肌醇，0.1 mM ，0.02 mM葉酸，12.5%馬血清，12.5% FBS，100-200 U/ml IL-2重組體的Alpha MEM培養基中培養。其它癌細胞培養在含有5% FBS，1%青霉素，1%螺旋霉素（GIBCO）的RPMI培養基中。NIH 3T3細胞培養在含有10%FBS，1%青霉素，和1%螺旋霉素的DMEM培養基中。

細胞溶解分析

靶細胞接種于96孔E-Plates上，每孔100 μl培養基。使用xCELLigence系統動態監測細胞直到對數期，此時形成了一細胞層（24-34小時，根據實驗）。不同濃度的效應細胞直接加入到含有靶細胞的各孔中，效應細胞加入到不含靶細胞的孔作為對照。加入效應細胞后，每隔15分鐘記錄一次測量結果，連續記錄20小時。

細胞形態鏡檢分析

使用Nikon直立顯微鏡觀察NK細胞介導的細胞溶解效應。加入效應細胞后，當細胞指數（Cell Index）相比對照下降到50%時，取出細胞用80%的甲醇固定5分鐘，使用Giemsa染色。鏡檢細胞形態學并用CCD相機進行記錄。

實驗數據分析

應用xCELLigence系統自帶的軟件，可對實驗全過程，即從接種到細胞溶解，進行顯示。通過實時顯示時間-E/T（效應細胞與靶細胞比值）的依賴性曲線，可動態監測NK細胞的活性。xCELLigence系統使用細胞指數（Cell Index）表示細胞阻抗。每點的CI值定義為（Rn-Rb）/15，其中Rn表示孔含細胞時的電極阻抗值，Rb是表示孔中只含培養基時的背景阻抗值。

為了對特定點細胞溶解進行定量，通過與對照的參比，特定E/T比率下的細胞溶解百分比以Excel形式輸出。

結果和討論

動態檢測NK細胞介導的細胞溶解

利用鼠NK細胞（mNK ）及靶細胞NIH 3T3細胞來監測NK細胞介導的細胞溶解活性。在96孔E-Plates板的每孔中接種5,000個NIH3T3細胞作為靶細胞，xCELLigence系統每小時記錄生長數據，直到34小時后細胞達到生長期。鼠NK細胞作為效應細胞，以不同的E/T比例直接加入到孔中，動態監測NK細胞介導的細胞溶解過程。如圖1A所示，與對照相比，當加入的mNK細胞E/T為15/1的時候，NIH 3T3細胞的細胞指數出現明顯的下降。而在效應對照孔中加入YAC細胞（無細胞溶解效應的T細胞），細胞指數沒有出現明顯的下降。這表明細胞指數的下降是由mNK特異性引起的，并且很有可能是由細胞溶解造成的。mNK細胞能夠引起NIH 3T3細胞的時間依賴性溶解，但YAC細胞沒有該效果（圖1B）。為了進一步證明細胞溶解效應，當細胞溶解達到50%時（添加mNK細胞后8小時），對靶細胞進行鏡檢。如圖1C所示，mNK細胞通過細胞溶解作用很快將靶細胞有效地清理掉，而對照YAC細胞對靶細胞沒有任何影響。

總之，使用xCELLigence系統是目前一種，不需要對靶細胞進行標記或添加任何化學指示物，就能夠直接檢測NK細胞介導的細胞溶解的方法。另外，該系統可以動態監測整個細胞溶解過程，這是利用基于標記的終點分析法所不能做到的。

圖1：動態監測NK細胞介導的細胞溶解

（A） 動態監測 NK細胞介導的NIH3T3細胞溶解。96孔E-Plate板每孔中接種5000個NIH3T3細胞。實時監測細胞粘附，擴散和增殖。細胞接種后34小時，CI值為3，等同于每孔大約10000細胞。每孔加入150,000mNK細胞或YAC細胞（陰性對照），每組三重復孔。（B）mNK細胞的時間依賴性溶解活性。計算特定時刻的細胞溶解活性，用細胞溶解百分比表示{細胞溶解%=（CI_對照－CI_效應細胞）/CI_對照X 100}。（C）mNK細胞作用后的形態學觀查。NIH 3T3細胞被mNK細胞特異性細胞溶解后，用Giemsa blue 染色后進行鏡檢。

定量檢測NK細胞介導的細胞溶解

細胞指數與細胞數目有關⁵，已經被用于定量監測化學物質，如抗癌藥引起的細胞毒性。為了檢驗mNK細胞的活性是否也可以定量分析，用不同比例的效應/靶細胞來檢測細胞溶解。利用鼠和人的NK細胞（mNK和NK92）作為效應細胞，NIH 3T3細胞和MCF7細胞（人乳腺癌細胞）分別作為效應細胞的靶細胞。如前所述，96孔 E-Plate板每孔接種5000個靶細胞，并用阻抗系統監測細胞生長。當靶細胞達到生長期，直接加入不同濃度的NK細胞。監測不同E/T比的NK細胞介導的細胞溶解。

如圖2所示，向靶細胞中加入mNK或NK92細胞后，與未加效應細胞的對照相比，細胞指數降低了。細胞指數的降低是依賴于E/T比的。細胞溶解過程中，細胞與電極相互作用的降低引起了細胞指數的降低。E/T越大，得到的細胞指數值越小。表明xCELLigence系統支持特異性NK細胞介導的細胞溶解活性的定量分析。而且，通過細胞溶解的動態監測，有助于更深入理解NK細胞介導的殺傷作用的潛在機理。例如對細胞溶解的動態分析，表明NK92細胞比mNK細胞的殺傷能力更強，E/T為4：1或更高時，加入NK92四小時內，90%的MCF7細胞都被溶解，而在相同的時間內加入mNK細胞只引起30%細胞溶解，NK細胞介導的細胞溶解動力學各不相同，表明效應細胞和靶細胞之間的相互作用，本質上是細胞特異性的，而且會有諸多因素的參與，如NK受體和配體的表達，或NK細胞介導的不同細胞溶解機制。

圖2：無標記定量分析mNK 和NK92細胞的溶解活性。（A）mNK細胞溶解活性的定量分析。NIH 3T3細胞接種到96孔E-Plate板，使用xCELLigence 系統實時監測，直到CI值達到3，相當于每孔10,000個細胞。將不同濃度的mNK細胞以不同的E/T接種到靶細胞中，并動態監測細胞的溶解活性。利用歸一化的細胞指數值表示，即加入mNK細胞得到的細胞指數值與同一孔加入mNK細胞前的細胞指數值的比 。（B） 不同E/T比下mNK的時間依賴性細胞溶解活性。mNK細胞介導的NIH 3T3的細胞溶解百分比的計算方法如圖1。時間依賴性細胞溶解活性如圖所示。（C）對NK92 細胞溶解活性的進行定量。接種MCF7靶細胞，xCELLigence系統監測細胞生長， NK92細胞以不同E/T比加入到靶細胞中，系統動態監測不同E/T比下的NK92細胞對MCF7的細胞溶解活性。（D）不同E/T比下的時間依賴性NK92細胞的溶解活性。NK92細胞對MCF7的細胞溶解百分比的計算方法如圖1。

無標記分析NK細胞對多種靶細胞的細胞溶解活性

利用8種不同的人類癌細胞和NIH 3T3細胞作為靶細胞，測試mNK和NK92的細胞溶解活性，表1和2總結了mNK 和NK92介導的細胞溶解對不同靶細胞的敏感性。NK92對癌細胞具有廣譜細胞溶解活性。加入NK92不到8小時就能夠達到殺傷活性。圖3A對比了NK92細胞對7種癌細胞的敏感性，其中四種靶細胞都出現超過90%的細胞溶解，包括H460, HepG2, Hela和MDA-MB231細胞。相反，mNK細胞介導的細胞溶解比NK92更具有選擇性（圖3B），參加測試的9種細胞中僅有4種（NIH3T3, A549, Hela, ａnd MDA-MB231）在加入mNK細胞后的12小時內，發生30%以上的溶解。OVCAR4, HT1080, HepG2, H460和MCF7五種細胞沒有發生溶解，或只是微弱的溶解（10%）。另外，mNK介導的細胞溶解比NK92要慢得多，加入mNK12小時后才達到值。

綜上所述，實驗證明，基于阻抗的xCELLigence系統可以用于NK細胞介導的細胞溶解活性的分析，且無需任何標記。人和鼠的NK細胞被用來對9種靶細胞（包括通常使用的人癌細胞）進行了實驗。該系統可以對NK細胞介導的細胞溶解進行動態定量分析，無需任何外源標記和額外試劑。而且這種全新的技術提供了全自動在線細胞溶解分析，可以用于大規模的篩選調節NK細胞介導的細胞溶解的化合物或基因。

圖3：無標記分析NK細胞介導的多種細胞溶解（A）NK92細胞介導的7種癌細胞溶解。細胞溶解的百分比是通過加入NK92細胞8小時后 計算細胞指數值得到的；此刻細胞溶解達到。（B）mNK細胞介導9種不同細胞溶解。細胞溶解的百分比通過加入mNK后12小時的細胞指數值計算得到的，此時細胞溶解達到。

表1： mNK細胞介導的9種細胞溶解

表2：NK92細胞介導的7種細胞溶解

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